QF-PCR چیست؟ | راهنمای کاربردی QF-PCR در تشخیص ناهنجاری ‌های کروموزومی

در حوزه ژنتیک مولکولی و تشخیص پیشرفته بالینی ما نیاز به استفاده از روش هایی سریع و دقیق داریم. در این بین استفاده از روش هایی کاربردی و با توان عملیاتی بالا می تواند برای متخصصان به یک چالش اساسی تبدیل شود. یکی از ابزارهایی که امروزه در محیط های آزمایشگاهی برای تحقق این هدف مورد استفاده قرار می گیرد QF-PCR است.

کاربرد این تکنیک در سال های اخیر توانست در تشخیص انواع ناهنجاری های کروموزومی عددی تحول قابل لمسی را ایجاد نماید. این مقاله با هدف ارائه یک راهنمای کاربردی در شناخت تکنیک QF-PCR طراحی شده است. در نتیجه کاربران با مطالعه این مقاله می توانند به طور مفصل با اصول QF-PCR در تشخیص پیش از تولد و همچنین کاربرد QF-PCR در آزمایشگاه آشنا شوند.

QF-PCR چیست و چه تفاوتی با PCR کلاسیک دارد؟

QF-PCR مخفف عبارت Quantitative Fluorescence Polymerase Chain Reaction است و آن را می توانیم نسخه ای بهبود یافته از واکنش های زنجیره ای پلیمراز معرفی نماییم. در این روش کاربر می تواند با افزودن نشانگرهای فلورسنت به پرایمرها و نوکلئوتیدها امکان کمی سازی همزمان PCR را فراهم نماید.

تفاوت اصلی این روش با روش های سنتی در این است که در این تکنیک کاربر نیاز به یک مرحله مستقل برای تفکیک محصول دارد. در نهایت نیز سیگنال های ارسال شده توسط نشانگرهای فلورسنت توسط یک آشکارساز لیزری خوانده و به شکل نمودار به نمایش در خواهد آمد.

در نهایت کاربر به کمک این روش می تواند به اطلاعات دقیق تری نسبت به روش PCR کلاسیک دست یابد. بنابراین تشخیص نسبت های آللی و کپی های ژنی یکی از دستاوردهای قابل توجه در این روش می باشد.

بخوانید: شناسایی گروه‌ های خونی در آزمایشگاه

نقش QF-PCR در تشخیص ناهنجاری ‌های کروموزومی عددی

از QF-PCR به طور معمول برای تشخیص انواع ناهنجاری های کروموزومی عددی استفاده می شود. همچنین باید به این موضوع توجه داشت که ناهنجاری های کروموزومی عددی، علت اصلی بروز بیماری هایی مانند سندروم داون، سندروم ادوارد و سندروم پاتو هستند.

برای تشخیص این مشکل می توان از روش های دیگری مانند کاریوتایپ و یا آنالیز ریز آرایه نیز استفاده نمود. البته کاربرد این روش ها می تواند بسیار زمان بر بوده و برای اجرای آن ما نیاز به سلول های زنده و کشت یافت داریم.

در نهایت همین امر سبب شده تا بسیاری از متخصصان برای تشخیص دقیق تر ناهنجاری های کروموزومی عددی از روش QF-PCR استفاده نمایند. در این روش ناهنجاری های کروموزومی عددی به سرعت شناسایی می شوند. در شرایط نرمال کروموزوم های هر فرد حاوی دو پیک با ارتفاع برابر در الکتروفروگرام ثبت می گردند.

این در حالی است که در ناهنجاری های کروموزومی عددی، این تعداد سه عدد ثبت می شود. همین روند ساده شناسایی ناهنجاری های کروموزومی سبب شده تا در بسیاری از مراکز تشخیص از این روش برای شناسایی مشکلات بالینی و ژنتیکی بهره ببرند.

آماده‌سازی نمونه برای اجرای QF-PCR در آزمایشگاه

در آزمایش QF-PCR مهمترین عامل تاثیرگذار برای نتایج حاصل از آزمایش کیفیت نمونه مورد بررسی است. در شرایطی که کنترل پیش از تولد صورت پذیرد، نمونه مورد بررسی مایع آمنیوسیت و یا سلول های پرز جفت خواهد بود. مراحل آماده سازی نمونه برای اجرای فرایند در ابتدا شامل استخراج DNA از نمونه می باشد.

به خاطر داشته باشید که مرحله استخراج DNA فرایندی کاملا تخصصی و حساس است. در نتیجه کاربر باید نسبت به اجرای دقیق این مرحله دقت کافی را داشته باشد و از روش های مناسب برای این منظور استفاده کند. در نهایت کیفیت DNA استخراج شده توسط روش هایی مانند نانو دراپ بررسی و سپس مراحل نهایی تکنیک QF-PCR اجرایی می گردد.

مراحل گام‌ به ‌گام انجام QF-PCR در محیط آزمایشگاهی

برای موفقیت در زمان اجرای QF-PCR نیاز است تا کاربران مسیر را به درستی و به صورت دقیق طی نمایند. در مرحله اول برای اجرایی نمودن این آزمایش نیاز است تا کیت های مناسب را برای اجرای روند دقیق آزمایش تهیه نماییم. برای اجرای این فرایند نیاز است تا زنجیره های پلیمراز مورد بررسی قرار گیرند.

برای اجرای این مرحله از دستگاه ترموسایکلر استفاده می شود. در ادامه نیز باید نمونه ها به دستگاه الکتروفورز مویینه ای تزریق شوند. این دستگاه به نمونه های ولتاژ بالایی انتقال می دهد و همین امر سبب مهاجرت قطعات DNA بر اساس اندازه آنها می باشد. در نهایت نیز لیزر با دریافت سیگنال های ارسال شده از طریق فلورسنت فرآیند آشکارسازی را اجرایی می نماید.

مزایا و محدودیت ‌های QF-PCR نسبت به روش ‌های دیگر

از مهمترین مزایای روش QF-PCR می توانیم به سرعت بالای اجرای آن اشاره نماییم. به طور معمول نتایج آزمایش تنها بعد از چند ساعت از استخراج DNA آماده می شوند. همچنین این روش از حساسیت بالایی برخوردار است و کاربر تنها با استفاده از مقدار بسیار محدودی از نمونه DNA می تواند فرایند فوق را اجرایی نماید. نتایج حاصل از این آزمایش کاملا دقیق و قابل استناد می باشند. محدودیت اصلی این روش نیز این است که کاربر تنها در زمان بررسی نمونه قادر به بررسی تعداد محدودتری لوکوس می باشد.

تفسیر نتایج QF-PCR و مواجهه با نتایج مشکوک

در آزمایش QF-PCR تفسیر صورت گرفته بر اساس نسبت ارتفاع پیک های آللی صورت می پذیرد. نسبت نرمال در این آزمایش به صورت یک به یک می باشد. بنابراین نتایج مشکوک به صورت نسبت های یک به یک و نیم شکل می گیرد. در صورتی که متخصص با چنین نتیجه ای مواجه شد نیاز دارد تا آزمایش را با استفاده از لوکوس های بیشتر تکرار کند.

بخوانید: طیف سنجی آزمایشگاهی چیست؟

کاربرد QF-PCR در غربالگری پیش از تولد و مشاوره ژنتیک

تکنیک QF-PCR در تشخیص پیش از تولد به دلیل سرعت و دقت در غربالگری ناهنجاری های رایج جایگاه ویژه دارد. در بسیاری از مراکز این آزمایش به عنوان یک تست سریع و تاکیدی در بررسی موارد مشکوک مورد استفاده قرار می گیرد. این آزمایش در دسته بررسی های غربالگری غیر تهاجمی دسته بندی می شود. در بررسی این آزمایش عموما از نمونه مایع آمنیوسنتز بهره می برند. در نتیجه اجرای این آزمایش به والدین این امکان را خواهد داد تا در مواجه با شرایط مشکوک تصمیمات آگاهانه تری بگیرند.

اهمیت یادگیری عملی QF-PCR برای ورود به حوزه سیتوژنتیک مولکولی

تسلط بر آزمایش QF-PCR صرفا فراتر از یک آزمایش ساده است و در آن نیاز به درک عمیقی از تعامل بین مولکول ها و نیاز های بالینی می باشد. در نتیجه نیاز است تا متخصصان دانش و مهارت کافی برای آماده سازی نمونه ها و کنترل دقیق شرایط اجرای فرایند QF-PCR را کسب نمایند. شناخت این تکنیک به متخصصان این امکان را خواهد داد تا نقش موثری در آزمایشگاه های پیشرفته سیتوژنتیک داشته باشند.

جمع‌بندی

در نهایت باید به این موضوع اشاره نمود که آزمایش QF-PCR به عنوان یک روش کمی ساز، سریع، قابل اعتماد، نقش محوری در تشخیص ناهنجاری های کروموزومی ایفا می نماید. امروزه در آزمایشگاه های پیشرفته سیتوژنتیک از روش های کاربردی مانند QF-PCR برای تشخیص بهره می برند. در نتیجه شناخت و تخصص در این زمینه می تواند زمینه درک بهتر از شرایط مراجعان را ایجاد نماید